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东翼以浅井久政为主，分为三阵：先阵，矶野员昌八百人；二阵，海北纲亲八百人；本阵，浅井久政一千人，合计两千六百人。
中线由熊谷元直指挥，分为五阵：一阵，熊谷元直率领一千三百名常备兵加上宇野村赖等北播磨众，总计三千人；二阵，波多野元秀率领南丹波众约三千人；三阵，浦上政宗率领西播磨众总计三千人；四阵，小寺政职率领东播磨众两千人；五阵，川胜广继率领北丹波众总计两千人，合计一万三千人。
西翼由荻野朝纲指挥，分为两阵：一阵，荻野朝纲率领的芦田党三千人；二阵，盐见赖胜所部两千人，合计五千人。
此外，熊谷隆直率领一千常备兵作为本阵，留守三田村城坐镇指挥。
在联军研究布阵的同时，六角军紧赶慢赶终于抵达了武田军正南方。面对来势汹汹的武田军，六角义贤认为他们长途跋涉，肯定军士疲惫、战力不高，因此对野战并不担心，六角诸将也是信心满满，决定与联军针锋相对。
东翼，由后藤贤丰指挥，同样分为三阵：先阵，蒲生定秀两千人；本阵，后藤贤丰两千人；三阵，目贺田纲清率领的爱知众两千人，总计六千人。
中线，由进藤贞治指挥，分为四阵：一阵，香西元成兄弟的细川晴元残部八百人；二阵，平井定武两千人；三阵，进藤贞治两千人；四阵，吉田重政一千人，总计五千八百人；
西翼，由三云定持指挥，分为两阵：一阵，越中孝俊的高岛众两千人；二阵，三云定持的甲贺众两千人，合计四千人。
另外，六角义贤率领两千军势驻扎在横山北麓的龙之鼻，今井肥前守率领五百人留守草野川与姊川交汇处，防备宫部继润趁机偷袭。
两军隔河相望，相距不过三四百步，双方的篝火映在河面上，像是两条金龙在黑暗中对峙。
五月十六日，辰时，天光大亮，姊川的水面在朝阳下泛着金色，两岸的军阵中，旗帜猎猎，枪尖如林，上至大将，下至足轻，皆是目光灼灼，蓄势待发。
中线的六角军阵中，香西元成全身披挂，头兜之下，面当之上，一双赤红的眼睛闪着凶光。自从细川晴元被刺以来，这个男人活着的唯一理由就是报仇。如今，仇敌就在对岸。
“我先去吧！”
他瞅了进藤贞治一眼，在得到肯定的颔首后，长枪一挥，与香西元广纵马冲入姊川，身后的八百人也呐喊着如同一把尖刀般扎向北岸。
“放！”
香西军渡到中流，熊谷元直的号令如惊雷炸开，北岸的铁炮队开始了第一轮铁炮齐射，白烟瞬间遮蔽了河面。弹丸如暴雨般倾泻在涉水渡河的香西军头上，冲在最前排的军士像被割倒的稻穗一般成片栽入水中，河水转眼染成了暗红色。
“都给我……”
香西元广话没说完，身体猛地一顿，一颗弹丸正中眉心，就这么张着嘴巴一头栽进了河水里。
“元广！”香西元成撕心裂肺地吼了一声，没等他从悲痛中缓过神来，第二轮齐射已经到来，他身边的军士一个接一个倒下，八百人脚还没踏上对岸，士气和攻势便已为之一挫。
看着这一幕，进藤贞治心头一沉：“全军出击！支援越后守！”
他一声令下，本部两千人与平井定武同时向北岸发起冲锋，试图以人数优势迫使铁炮队后撤，或者尽快冲到对岸使得铁炮失去用武之地。
东翼，浅井军阵中，矶野员昌攥着枪杆的手青筋暴起，铁炮那“砰砰砰”的声响像是一记记重锤敲在六角军的肉体上，也同时敲在了他的心头——这就是武田军威名赫赫的铁炮队，比焙烙玉和长弓要管用一万倍！
“看到了么！”他回头对身后的军士吼道，“这就是咱们的后盾！想报佐和山城的仇，现在不冲，更待何时？！”
同样地，他也率领八百人咆哮着涌入姊川，他的勇猛不输香西元成，一马当先杀过河去，长枪如蛟龙出水，直刺蒲生定秀先阵。
蒲生定秀的兵力几乎是矶野员昌的三倍，可矶野员昌根本不管这些，他已然杀红了眼，枪尖连挑三人，身后八百浅井军个个红着眼珠子跟着往前猛冲，佐和山城的耻辱、番场城的背叛、地头山的惨败，所有憋屈在这一刻全变成了杀意。
不过多时，蒲生军的阵线竟被生生撕开了一个口子。
此战是蒲生定秀之子蒲生贤秀的初阵，这个十五岁的少年初生牛犊不怕虎，持枪迎上矶野员昌，可两人只战了一回合，他便被矶野员昌的力道震得虎口发麻，枪杆脱手，若非后藤贤丰及时率兵赶到，他这颗脑袋怕是留不住了。
海北纲亲见矶野员昌大杀特杀，二话不说率部加入战斗，浅井久政见敌我比例悬殊，除了令海北纲亲前去支援，还向中线的熊谷元直求援，后者当即调小寺政职两千人支援东翼，六角军刚刚依靠兵力优势形成的一波反击很快就被堵了回去，双方在南岸陷入了鏖战。
西翼几乎同时开打，誓要立功的芦田党，如同一群出了笼的野狼扑向高岛众，令人意外的是，打头的不是荻野朝纲，而是他的养子荻野直正。
这小子年仅二十岁，却是身材魁梧，手里一柄太刀舞起来虎虎生风。双方刚一接阵，他便劈翻了高岛众的一名武士，紧接着，又斩断对方足轻的枪杆，众人还没缓过神，太刀凌空一闪，朝着“高岛七头”田中氏当主田中赖长的肩口斜劈而下，一颗脑袋划着弧线飞进一旁的水草丛中。
“鬼啊！那是鬼！”高岛众的足轻尖叫着连连后退。另一名“高岛七头”的首领平井赖氏试图挡住这个少年，可要冲到他跟前，便被迎面而来的芦田党武士从侧面一刀砍断了脖子。
高岛众本以为这次是跟着六角家蹭军功的轻松差事，何曾想到会遇到这种玩命的军士？一门惣领越中孝俊拼命呼喝着维持阵线，可田中赖长、平井赖氏相继毙命已然摧毁了军心，开战仅仅半个多时辰，高岛众便已行将崩溃。
眼见大事不妙，三云定持只能率甲贺众加入战斗。盐见赖胜闻讯也渡河赶来增援，兵力本就处于劣势的六角军西翼陷入巨大被动之中，坚持了两刻钟，三云定持还是撑不住向六角义贤派出使番求援。
六角义贤收到求援的消息后脸色铁青，他不敢相信自己的耳朵，开战不到一个时辰，西翼就顶不住了？
可事实确实如此，由不得他不信。思忖片刻，他还是下令：“快，让出云守去支援！”
使番飞奔向吉田重政的阵地，可一会功夫，便带回了一句让他心凉半截的话：“出云守大人说，中线也在吃紧，无法抽身！”